CIKLINIO ADENOZINMONOFOSFATO (cAMP) KAUPIMASIS TERPĖJE SU ŽMOGAUS KRAUJO PLOKŠTELIŲ MEMBRANOMIS

(Matematinis modelis R. W. Farndale ir kt.(1992) straipsnio pagrindu)

Kolagenas yra stiprus trombocitų aktyvatorius, sukeliantis trombocitų granulių sekreciją ir trombocitų suspensijų agregaciją, taip pat kraujagyslių sienelių kolagenai, kaip manoma, yra pirminiai fiziologiniai dirgikliai hemostatiniams procesams. Kolageno – trombocito sąveika taip pat yra svarbi kraujagyslių sienelių patologijai (Barnes, 1988). Yra žinoma, kad kolagenas trombocituose dalyvauja tarpmembraniniuose signaliniuose keliuose, nors ir trūksta tikslaus supratimo apie receptorių išsidėstymą ant trombocitų paviršiaus, kurie yra atsakingi už kkolageno surišimą ir tolimesnę jų aktyvaciją guanin-nukleotidus rišančiais baltymais (G baltymais) ir fermentais efektoriais. Trombocitas yra valdomas per su membrana susijusių signalinių kelių pusiausvyrą. Manoma, kad fosfolipazės turi lemiamą įtaką aktyvizacijos procesams trombocituose; kartu su fosfolipazės –A2 aktyvumu , esant tokioms medžiagoms kaip kolagenas ir trombinas, susiformuoja tromboksanas A2 , kuris pats yra stiprus aktyvuojantis veiksnys. Fosfolipazės C aktyvumas taip pat gali būti stimuliuojamas kolagenu, su sekančiu po to vidinės Ca2+ koncentracijos ir protein kinazės C aktyvumo trombocituose padidėjimu. Šie kkeliai yra svarbūs pirminiai trombocitų aktyvacijos komponentai; tolimesnė sekrecija iš trombocitų granulių veda prie minėtų veiksnių sustiprėjimo, kadangi granulių turinys, pvz., ADP ir 5-hidroksitriptaminas (5HT) turi aktyvuojančių savybių.

Šie signalai trombocituose yra atsveriami cirkuliuojančiais adenilat- ir guanilatciklazės keliais. Jie yra skatinami ddaugiausiai prostaciklinu ir azoto oksidu, kurie gali būti įgyti tiesiogiai per kraujagyslių endotelį. Aktyvacijos procesas trombocituose yra palengvinamas adenilatciklazės inhibicija, nors ir nėra įrodyta, kad inhibicija yra besąlygiškai reikalinga prieš kiekvieną trombocito aktyvaciją. Trombocito produktai: ADP, 5HT, ir tromboksanas A2 , kurie yra išskiriami aktyvacijos metu, kartu su trombinu ( pagamintu koaguliacijos proceso metu); kiekvienas iš jų yra varžantis veiksnys adenilatciklazei. Buvo pasiūlyta, kad kolagenas pats yra ir tiesioginis inhibitorius, nors tam yra mažai detalių įrodymų. Pavyzdžiui, Chiang et al. (1975) panaudojo kolageną skatinant 5HT kaupimąsi ir išsiskyrimą trombocituose, ir taip pastebėjo kartu vykstantį ciklinio AMP kiekio mažėjimą. Jų bandymų detalus tikslas buvo sekrecijos ištyrimas, ir žemesni cAMP kiekiai buvo pastebėti esant kolageno ir iš kolageno kilusioms medžiagoms kaip antrinis ppoveikis po adenilatciklazės inhibicijos. Trombocitų aktyvacija taip pat nulemia ryškius jų morfologijos pokyčius, ir nėra visiškai aišku, ar šie fiziko-cheminiai pakitimai trombocitų membranoje neįtakoja adenilatciklazės sistemos aktyvumo ; membraninė aplinka yra žinoma kaip lemiantis veiksnys adenilatciklazės aktyvumui.

Kitame moksliniame darbe Misselwitz et al. (1987), iš dalies kontroliuodami ADP atliekinę sistemą sekrecijos rezultatais iš sveikų trombocitų, įdėdami indometacino (ciklo-oksigenazės inhibitoriaus), kartu su gerokai mažesniais fosfokreatino ir kreatino kinazės kiekiais, ir nors mokslininkai pastebėjo mažesnius cAMP kiekius po adhezijos su kolagenu ppadengtais substratais, tai galėjo būti įtakota adenilatciklazės inhibicija 5-hidroksitriptaminu, išsiskyrusiu iš vidinių šaltinių, arba padidėjusiu fosfodiesteraziniu aktyvumu.

Dar labiau įtikinantis tiesioginio kolageno poveikio įrodymas buvo pateiktas ankstyvaisiuose Salzman ir Levine (1971) darbuose, kurie panaudojo šalčiu apdorotus trombocitus (su didesne skvarba) be tolimesnio membranų atskyrimo, kad būtų pademonstruota adenilatciklazės inhibicija. Iš šio darbo matome, kad tiesioginis kolageno veikimas ir antriniai veiksniai, tokie kaip tromboksano gaminimas ir granulių išskyrimas, buvo visiškai atskirti nuo pirminio kolageno, susiejant tai su ląstelių pralaidumu. Vis dėlto, ši studija iš anksto kalba apie dabartinį adenilatciklazės inhibicijos kelių supratimą, taigi reikia daugiau detalių tyrimų, kad būtų nustatytas tikslus kolageno poveikis trombocitų adenilatciklazės inhibicijai.

Bandymai su adenilatciklaze yra patogūs ir lengvai atkuriami. Žemiau aprašytame tyrime buvo siekiama nustatyti, ar tai gali būti panaudojama ankstyvų ir tiesioginių atsitikimų, sekančių po trombocitų membranų ir kolageno sąveikos, supratimui. Visų pirma, buvo norima nustatyti pasiūlyto adenilatciklazės inhibicijos žmogaus trombocituose mechanizmo prigimtį.taip pat buvo siekiama pažiūrėti, ar mechanizmas jautrus tokiems kolageno struktūros pakitimams, kurie galiausiai įgalintų ištirti kolageno molekulės domenus, kai jie sąveikauja su trombocito paviršiumi.

Aukščiau nurodyti signaliniai keliai yra aktyvuojami ligandais, kurie susiriša su specifiniais receptoriais ant kraujo plokštelės paviršiaus. Yra gerai nustatyta, kad toks sąryšis gali vesti prie tam tikros trimerinių GG baltymų klasės aktyvacijos, kurie savo ruožtu moduliuoja specifinių fermentų efektorių aktyvumą. Šie įvykiai sukelia pokyčius citozolinėje aplinkoje ir trombocito funkcijoje, dažnai kaip ir pakitęs proteinkinazės aktyvumas. Adenilatciklazė geriausiai yra charakterizuojama šiais signaliniais keliais, ir yra žinoma, kad teigiamas adenilatciklazės atsakas vyksta tarpininkaujant Gs, stimuliuojančiu G baltymu (Gilman, 1987). Ir priešingai, adenilatciklazės inhibitoriniai signalai (žr. Northup, 1985) trombocituose bent jau adrenalino atveju, yra veikiami Gi2, vienu iš keleto genetiškai skirtingų inhibitorinių G baltymų (žr. Milligan, 1988), kurie ypatingi tuo, kad jų veikimas yra blokuojamas kovalentine modifikacija, įvedant kokliušo toksino. Tokie kokliušo toksinams jautrūs G baltymai yra įtraukti ir į kitų signalinių kelių aktyvaciją, tokių kaip fosfolipazės A2 ir fosfoinozitazė C, nors pastarajai tai yra ginčytina tema, nes iki šiol dar nebuvo nustatyta jokių G baltymų, kurie atliktų šią funkciją visų tipų ląstelėse. G baltymų paplitimas trombocituose yra labai sudėtingas; be Gs, yra žinoma, kad randama Gi2, Gi3 (Simonds et al., 1989), Gz (Carlson et al.,1989), kartu su daugybe 20-25 kDa su guaninu susijusių baltymų (Bhullar  Haslam, 1987; Ohmori et al., 1989), kaip ir, turbūt, panašiu į G0 vientisumu.

Dauguma signalinių kelių, aktyvuotų trombocituose kolagenu, kaip manoma, yra priklausomi nuo G baltymų, nors tik labai nedaugelyje mokslinių darbų yra demonstruojama GG baltymų aktyvacija kolagenu. Tuose darbuose (pvz., Lapetina et al.,1986; Walker  Bourgignon, 1990 ), tiesioginis ryšys tarp kolageno receptorių ir G baltymų nebūtinai yra nustatomas, kadangi, kaip minėta anksčiau, antriniai veiksniai trombocito aktyvacijos proceso metu gali paskatinti nu G baltymų priklausomuų kelių stimuliavimą. Norint išvengti tokių neaiškumų, šio mokslinio darbo tikslas buvo ištirti pirminius veiksnius kolageno ir trombocito sąveikoje, taip pat ir duoti supratimą apie G baltymų aktyvavimą kolagenu trombocito membranoje.

Duomenys ir jų analizės metodai

Bandymų duomenys, analizuojami šiame darbe, yra gauti kitų tyrėjų VGTU Bioinformatikos laboratorijoje (pateikti priede [kursinis]).

Modelis buvo derinamas su bandymų duomenimis, vadovaujantis pratybų aprašu [Kaip.xls] ir naudojantis pratybų metu savarankiškai sudaryta patikros programa (Microsoft Excel) [Pratybos.xls].

Darbo tikslas :

Šio darbo tikslas yra pateikti labiausiai tikėtiną cAMP kiekio žmogaus kraujo plokštelių membranose augimo mechanizmą, dalyvaujant fermentui adenilatciklazei, bei šio proceso slopinimą esant kolageno skaiduloms.

Rezultatai ir jų aptarimas

Proceso mechanizmas:

Pagrindinė darbo schema:

ATP virsta cAMP+2Pi su adenilatciklazė fermento pagalba

Matematinis modelis:

Vadovaujantis pratybų duomenimis buvo sudaryta lygtis:

(1)

čia: α-santykinis cAMP sintzės greitis;

β-santykinis adenilatciklazės aktyvumo mažėjimo greitis;

y-cAMP kiekis.

Šios lygties sprendinys yra toks:

(2)

Antra lygtis yra pritaikyta prie pirmojo modelio antrajame modelyje atsiranda dar vienas parametras toks kaip kolageno poveikis,todėl antrojo modelio lygtis atrodo taip:

(3)

čia: K-kolageno poveikis.Visi kiti

parametrai buvo auksčiau paminėti.

Modelio derinimas su bandymų duomenimis :

Pirmiausia buvo derinama (2) lygtis, kaitaliojant α,β, parametrus pagal kreivės ir duomenų taškų artumą (vizualiai). Toliau tokiu pat būdu buvo derinama (3) lygtis, kuri skirasi vienu papildomu parametru – K.

Modelio patikra (dispersinė analizė):

Dispersinė analizė pateikta 2 lentelėje. Jos rezultatas (Excel funkcijos FDIST(F,n1,n2) reikšmė) nusako tikimybę, kad, atmetus pateiktą modelį kaip prieštaraujantį bandymų duomenims, būtų padaryta klaida. Kadangi FDIST(F,n1,n2) = 0,676 > 0.05, modelį atmesti nėra pagrindo. O tai savo ruožtu reiškia, kkad negalima atmesti ir prielaidų, kurių pagrindu jis sudarytas.

2 lentelė. Modelio patikra (dispersinė analizė). Mėlyna spalva išskirtame langelyje pateiktas pagrindinis analizės rezultatas (FDIST(F,n1,n2); čia F – Fisher’io santykis, n1 ir n2 – laisvės laipsniai) . Raudona spalva pažymėti skaičiai yra tarpiniai skaičiavimo rezultatai. Geltona spalva išskirtuose langeliuose yra modelių parametrai jų reikšmės.

Išvados :

Ciklinio adenozinmonofosfato (cAMP) kaupimasis terpėje su žmogaus kraujo plokštelių membranomis( su arba be kalogeno) galima vienareikšmiškai aprašyti matematiniu modeliu – dviem lygtimis su trimis parametrais.Pirmame modelyje yra pritaikyta aantra lygtis kurioje yra du parametrai α-santykinis cAMP sintezės greitis, β-santykinis adenilatciklazės aktyvumo mažėjimo greitis.Antrame modelyje yra pritaikyta trečia formulė su trimis parametrais: α, β ir K-kolageno poveikis.

Literatūra:

1. A.Juška, Modeliai biologijoje. Paskaitų konspektas. (2002) Vilnius, VGTU.

2. A. Juška, Modeliai biologijoje. PPratybų aprašas. (2002) Vilnius, VGTU.

3. R.W.Farndale, A.B.Winkler, B.R.Martin, M.J.Barnes. Inhibition of human platelet cyclase by collagen fibres,1992.